免疫学检测技术

 

• 一  免疫荧光试验
  1. 原理：根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。方法具体种类有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。
  2. 检测流程示例
     1. 固定：将组织、细胞固定于载玻片上；
     2. 一抗反应：加入标本或试剂，孵育、清洗；
     3. 二抗反应：加入荧光素标记的二抗，孵育、清洗；
     4. 检测：用荧光显微镜观察。
  3. 结果判断
     1. 定性：阴性、阳性；
     2. 半定量：阳性标本经稀释后检测可测出其滴度。

• 二  中和试验
  1. 原理：病毒与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，由此建立的免疫学试验称之为中和试验。主要分为终点法中和试验、空斑减少法中和试验。
  2. 检测流程示例
     1. 病毒滴度测定：终点法测定病毒TCID50（细胞培养半数感染量）；
     2. 培养细胞：在96孔细胞培养板中加入细胞悬液，培养细胞长至单层；
     3. 中和病毒：待测血清热灭活后2倍递进稀释，与稀释至固定浓度的病毒混合，充分反应；
     4. 接种细胞：将中和后的病毒、血清混合液接种到细胞中，培养一段时间；
     5. 计算结果：观察、记录各组的保护数，计算其PD50（半数保护量），即该血清的中和价。
  3. 结果判断：半定量，可测定抗血清的效价。

• 三  琼脂扩散试验
  1. 原理：利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应。琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。
  2. 检测流程示例
     1. 制备凝胶板：加热溶化琼脂糖，倒在平皿或玻板上制成琼脂糖凝胶板，冷却后按所需形状打孔，如梅花孔。
     2. 免疫扩散：将抗原加入中心孔，倍比稀释的血清加入周围孔。置于湿盒中，保温扩散24~48小时。
     3. 观察结果：观察抗原抗体反应产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
  3. 结果判断
     1. 定性：阴性、阳性；
     2. 半定量：可测定血清的滴度。

• 四  红细胞凝集抑制试验
  1. 原理：某些病毒能够与红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。
  2. 检测流程示例
     1. 制备1%红细胞悬液：经采血、离心、分离、清洗等一系列步骤后，制备红细胞泥，稀释至工作浓度。
     2. 抗原抗体反应：将待检血清在96孔V形板中2倍递进稀释，每孔加入配制好的抗原或病毒，混匀后，静置反应一段时间。
     3. 血凝反应：将1%红细胞悬液加入各孔，混匀后，静置反应一段时间。
     4. 观察结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。
  3. 结果判断：半定量，可测定抗血清的效价。

• 五  免疫过氧化物酶单层试验
  1. 原理：通过细胞上接种的病毒捕获待检血清中的抗体，通过辣根过氧化物酶标记的二抗与抗体结合显色，从而检测血清中抗体。
  2. 检测流程示例
     1. 制备诊断板：消化、稀释制备细胞悬液，加入96孔细胞培养板中培养；然后接种病毒，培养；清洗后，固定、干燥，储存于-70℃备用。
     2. 一抗反应：倍比稀释血清，加入到孔中与病毒反应，孵育、清洗；
     3. 二抗反应：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育、清洗；
     4. 染色：加入染色液，避光染色一段时间，弃去染色液后清洗；
     5. 观察结果：在倒置显微镜下判读。
  3. 结果判断：半定量，血清滴度以50%或以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。
• 六  免疫胶体金层析试验
  1. 原理：待检样品中的抗体通过层析作用在硝酸纤维素膜载体内定向移动，与胶体金标记的二抗结合后，在检测区域与固定的抗原结合并富集显色。
  2. 检测流程示例
     1. 制备胶体金试纸条：包括标记胶体金、包被、划线、封闭、烘干、剪切等一系列工序。
     2. 加样：将待检血清滴加至加样区内，并加入缓冲液。
     3. 观察结果：15分钟后肉眼观察。
  3. 结果判断：定性。

• 七  酶联免疫吸附试验
  1. 原理：96孔板中包被的抗原捕获待检血清中的抗体，通过酶标记的二抗与抗体结合，酶催化底物显色，从而检测血清中抗体，此为间接法，另外还有夹心法、竞争法等，原理与此类似。
  2. 检测流程示例
     1. 制备试剂盒：包括标记酶、抗原或抗体包被微孔板等一系列工序。
     2. 一抗反应：加入待检血清，孵育、清洗；
     3. 二抗反应：加入酶标记二抗，孵育、清洗；
     4. 显色：加入显色剂，孵育，加入终止液；
     5. 检测：用酶标仪读取吸光度。
  3. 结果判断：定性、定量。

• 八  磁微粒化学发光免疫分析试验
  1. 原理：微米级别粒径的磁珠表面包被抗原，捕获待检血清中的抗体，通过酶标记的二抗与抗体结合，酶催化底物发光，通过发光强度可计算出血清抗体量，此为间接法，另外还有夹心法、竞争法等，原理与此类似。
  2. 检测流程示例
     1. 制备试剂盒：包括标记酶、抗原或抗体包被磁珠等一系列工序。
     2. 一抗反应：加入待检血清，孵育、清洗；
     3. 二抗反应：加入酶标记二抗，孵育、清洗；
     4. 发光：加入底物，孵育；
     5. 检测：读取相对发光强度。
  3. 结果判断：定性、定量。